Лабораторная диагностика при гепатите в

Первичная диагностика гепатитов, лабораторная диагностика гепатитов

Срок исполнения – 2 р.д.

Стоимость программы: 1600 руб. Заказав программу, Вы сэкономите 230 руб.

в стоимость программы не включена стоимость забора крови (100 руб.)

Код услуги: 300010
Наименование услуги: Первичная диагностика гепатитов

Важно : Подготовка к исследованию и правильный забор биоматериала являются
важными факторами, влияющими на качество лабораторной диагностики.

В программу лабораторной диагностики гепатитов включены тесты для первичной диагностики вирусных гепатитов А, В и С. Исследования рекомендуются при подозрении на гепатит (т.е. при следующих клинических проявлениях: общая слабость, снижение аппетита, тяжесть в правом подреберье, пожелтение кожи и склер, обесцвечивание кала, потемнение мочи). Но так как вирусные гепатиты могут протекать бессимптомно, комплекс этих тестов следует проходить периодически каждому здоровому человеку, особенно если Вы имеете половую связь с более чем одним партнером или Ваш половой партнер болен гепатитом; если Вы употребляете наркотики внутривенно; если Вы живете с больным хроническим гепатитом; если Вы работаете с человеческой кровью; если Вы посещали стоматолога или косметолога, делали татуировку или пирсинг.

Аланин-аминотрансфераза — АЛТ (код 090014)

Аспартат-аминотрансфераза — АСТ (код 090015)

Вирус гепатита А, определение антител класса IgМ — anti-HAV IgM (код 040002)

Вирус гепатита В, определение поверхностного антигена – HbsAg (код 040101)

Вирус гепатита В (Hepatitis B Virus), определение антител класса IgМ к ядерному антигену — anti-HBc IgМ (код 040105)

Вирус гепатита С (Hepatitis C Virus), определение антител класса IgМ — anti-HCV IgM (код 040202)

Вирус гепатита С, определение антител класса IgG — anti-HCV IgG (код 040201)

Материал для исследования: кровь (сыворотка)

Подготовка к исследованию: Забор крови проводится натощак (не менее чем через 6-8 часов после последнего приема пищи), предпочтительней в утренние часы.

с понедельника по пятницу: с 7.30 до 19.00

в субботу: с 8.00 до 19.00

в воскресенье: с 8.00 до 17.00

Лабораторная диагностика гепатита

Лабораторная диагностика гепатита проводится после окончания инкубационного периода, чтобы не было сомнений в результатах анализов. Вообще для начала проводится биохимия крови. Ее достаточно, чтобы обнаружить изменения состава крови. Но для окончательного диагноза этих данных недостаточно. Нужно точно определить тип гепатита. Только в таком случае возможно адекватное лечение.

Медицинские центры на Ленинском проспекте и улице Миклухо-Маклая проводят комплексную лабораторную диагностику гепатитов А, В, С. Определяется концентрация специфических антител острой и хронических форм, выявляется поверхностный антиген HbsAg. В комплексную программу входит также оценка АЛТ и АСТ. Подъем их уровней прямо пропорционален некрозу паренхимы печени.

Острый гепатит, независимо от этиологии, приводит к росту АЛТ. Значение анализа изменяется за 10-15 дней до желтухи при вирусном гепатите А. Максимальное значение достигается на 2-3 неделе. Приходит в норму через 30-40 суток. Повторное нарастающее увеличение указывает на новый некроз, рецидив. Удлинение периода высокой активности указывает на то, что острый гепатит принял форму хронического.

АСТ растет при острой форме гепатита, иных тяжелых поражениях печени. Умеренный рост значений лабораторной диагностики указывает на механическую желтуху, цирроз.

Комплексный подход к лабораторной диагностике позволяет точно поставить диагноз и быстрее провести лечения, не допустив развития хронической формы. Помните, что гепатиты сегодня являются распространенными заболеваниями, у которых нередки латентные формы. Пройдите обследование прямо сейчас.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ

А. А. Асратян Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН,
Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Основой лабораторной диагностики вирусных гепатитов служат:

— знания об их возбудителях и репликации

— информация о появлении и исчезновении маркеров инфицирования

— современные иммунохимические и молекулярно- биологические методы детекции антигенов, антител и нуклеиновых кислот/

Лабораторная диагностика гепатита В (ГВ) Строение вириона см. рис. 1.

Лабораторная диагностика ГВ — основана на выявлении специфических для ГВ антигенов и соответствующих антител в крови, а также вирусных нуклеиновых кислот, основными из которых являются:

НВ sAg — анти-НВ s

анти-НВс класса Ig М и IgG

НВе Ag — анти-НВе

Наиболее широко в диагностике ГВ используется определение НВsAg. Данный антиген выявляется как при остром, так и при хроническом заболевании (однако острая инфекция обычно подтверждается наличием высоких титров анти-НВс IgМ). При остром ГВ поверхностный антиген вируса обнаруживается через 3-5 недель от момента инфицирования, то есть задолго до появления клинических признаков болезни и в этих случаях является единственным серологическим маркером. НВsAg постоянно выявляется в преджелтушном и желтушном периодах болезни. Персистирование НВsAg в течение 6 месяцев и более указывает на затяжное или хроническое течение болезни, и позволяет предположить хроническое носительство вируса. Элиминация НВsAg и появление антител к нему является непременным условием выздоровления. Серологическими маркерами репликации ВГВ являются — анти-НВс класса IgМ, НВеAg, ДНК и ДНК-полимераза, которые обнаруживаются при остром ГВ с первых дней клинических проявлений и могут обнаруживаться при обострении хронического ГВ. Серологические маркеры репликации ВГВ определяют как в целях общей диагностики, так и для оценки эффективности применяемой терапии. НВсAg выявляется в ткани печени и не определяется в сыворотке крови. Опосредовано его присутствие в организме отражают циркулирующие антитела – анти-НВс класса IgМ и IgG. В острый период ГВ наличие анти-НВс класса IgМ является дополнительным маркером этого заболевания. Однако необходимо учитывать, что около 50% больных хроническим ГВ также могут иметь эти антитела в периоде обострения, но чаще в низких концентрациях. Наличие в сыворотке крови только анти-НВс класса IgG наблюдается в период между исчезновением НВsAg и образованием анти-НВs. Сочетанное выявление анти-НВс класса IgG в низком титре с анти-НВs указывает на перенесенную ГВ-инфекцию и наличие иммунитета. Тестирование НВеAg проводят в сыворотках крови только с наличием НВsAg и позитивный результат данного маркера свидетельствует об активном процессе – либо подтверждает диагноз острого ГВ, либо свидетельствует об обострении хронического ГВ. Длительность циркуляции НВеAg имеет важное прогностическое значение: выявление НВеAg через 2 и более месяца после начала заболевания служит признаком возможного развития хронического гепатита. Выявление НВеAg без присутствия НВsAg в сыворотке крови в подавляющем большинстве случаев указывает на ложный результат анализа. Однако больные, инфицированные мутантным вирусом могут оставаться серонегативными по НВеAg, несмотря на сохраняющуюся инфекционность и наличие анти-НВе Наличие ДНК-ВГВ (наиболее чувствительный маркер продолжающейся репликации ВГВ) в сыворотке крови указывает на высокую инфекционность данного образца и активное размножение вируса в организме. Позитивный результат удается зарегистрировать практически у всех больных острым ГВ в разгар заболевания. Снижение его концентрации в процессе лечения хронического гепатита является хорошим прогностическим признаком, указывающим на эффективность применяемой терапии. Высокая активность аминотрансфераз сыворотки отражает воспалительное повреждение ткани печени, вызываемое преимущественно реакциями иммунной системы организма против инфицированных вирусом гепатоцитов, а не прямым цитопатическим действием вируса. Высокий уровень ДНК-ВГВ в сочетании с низким уровнем аминотрансфераз свидетельствует о недостаточном иммунном ответе организма. Выявление анти-НВе при отсутствии НВеAg и ДНК-ВГВ свидетельствует о закончившейся активной репликации инфекции. Сероконверсия НВsAg в анти-НВs происходит у 90-95% больных с острым ГВ в стадии разрешения инфекционного процесса и, является показателем иммунитета к вирусу ГВ, то есть наличие анти-НВs свидетельствует о перенесенной инфекции и наличие иммунитете к этой инфекции. Лица, имеющие эти антитела в защитной концентрации (10 МЕ и более) не болеют ГВ и не нуждаются в вакцинации. Все применяемые методы исследования для определения специфических маркеров ГВ можно разделить на 2 группы – иммунохимический и молекулярно-биологические. Иммунохимические – основное место принадлежит иммуноферментному анализу (ИФА) с его высокой чувствительностью и специфичностью, простотой проведения и стабильностью реактивов. Молекулярно-биологические – точечная и жидкостная гибридизация, а также цепная полимеразная реакция (ПЦР) – позволяет выявлять наличие ДНК-ВГВ непосредственно, либо с помощью определения вирусоспецифического фермента – ДНК- полимеразы. НВ sAg /анти-НВ s Для выявления основного маркера ВГВ, разработаны разнообразные методы, позволяющие определить антиген в концентрации до 0,05 нг/мл, которые подразделяются на так называемые «поколения» (табл. 1). В настоящее время основным методом обнаружения НВsAg является ИФА Важным этапом в развитии лабораторной диагностики вирусных гепатитов в России стали проведение (с 1998 г.) сравнительных испытаний диагностических препаратов для оценки их качества под эгидой МЗ РФ. Современные диагностические препараты обладают высокой специфичностью, но возможны и ложноположительные результаты. Для разграничения ложноположительных от истинно положительных результатов применяется тест нейтрализации НВsAg – специфической сывороткой. Принципиально новым для системы выявления НВsAg стало требование к отечественным производителям диагностических препаратов – обязательное включение в тест-систему слабоположительного контрольного образца, содержащего НВsAg в концентрации 1 нг/мл. Для определения анти- НВsAg был испытан весь спектр иммунохимических методов, основной из которых сейчас – ИФА (для качественного и количественного анализа). Анти-НВс класса Ig М и IgG , НВе Agанти-НВе (рис. 2 и табл. 2) Для тестирования этих маркеров могут быть использованы различные варианты твердофазного иммуноанализа: иммуноферментный, радиоиммунный, химиолюминисцентный и их различные варианты. ДНК ВГВ — определяют при помощи проведения ПЦР– анализа. В настоящее время наиболее широкое распространение получили амплификационные методы детекции ДНК ВГВ. Появилась возможность определять ДНК ВГВ в качественном и количественном варианте.

Лабораторная диагностика гепатита Д (ГД) Вирус гепатита Д (ВГД) – это дефектный вирус, содержащий одно-спиральную РНК, которому для репликации необходимо помощь вируса ГВ для синтеза оболочечных белков, состоящих из HBsAg, который используется для инкапсуляции генома ВГД. ВГД не принадлежит ни к одному из известных семейств вирусов животных, по своим свойствам ВГД наиболее близок к вироидам и сателлитным вирусам растений. Лабораторная диагностика осуществляется путем обнаружения серологических маркеров ВГД, включая наличие антигена, антител к нему и РНК ВГД. Обнаружение антигена ВГД и РНК ВГД в сыворотке крови или ткани печени свидетельствует о наличии активной ГД-инфекции, однако, следует отметить, что эти маркеры могут не обнаруживаться в сыворотке больных фульминантным ГД. Маркером активной репликации ВГД также является анти-ВГД класса IgМ. Серологические маркеры инфекции ГД зависят от того, как был приобретен вирус – в виде коинфекции с ВГВ (у большинства больных заболевание имеет острое течение и заканчивается выздоровлением) или суперинфекции у больных с хронической ГВ-инфекцией (протекает тяжелее, чем коинфекция — в 10% развивается фульминантный гепатит). При коинфекции в большинстве случаев антитела — анти-ВГД класса IgМ и IgG — обнаруживаются в течение заболевания. Титр анти-ВГД обычно снижается до практически неопределяемых уровней после выздоровления, и не сохраняется никаких серологических маркеров того, что человек был когда-либо инфицирован ВГД. Антиген ВГД определяется только у 25% больных и обычно исчезает вместе с исчезновением HВsAg. При суперинфекции у больных с хронической ГВ-инфекцией серологическая картина имеет следующие характерные особенности: – титр HBsAg снижается к моменту появления антигена ВГД в сыворотке; — антиген ВГД и РНК-ВГД продолжают определяться в сыворотке, так как обычно у большинства пациентов с суперинфекцией ГД (70-80%) развивается хроническая инфекция, в отличие от случаев коинфекции; — определяются высокие титры антител (анти-ВГД) как класса IgМ, так и IgG, которые сохраняются неопределенное время. Серологические маркеры вируса ГД определяют методом иммуноферментного и радиоиммунного анализа, а РНК-ВГД — методом полимеразной цепной реакции. Отечественными и зарубежными промышленными биотехнологическими предприятиями выпускаются диагностические наборы, включающие все необходимые компоненты и реактивы для постановки теста. В диагностических препаратах используют дельта-антиген, полученный из печени сурков, экспериментально зараженных ГД; антиген, выделенный из печени погибших носителей ВГД; дельта-антиген, полученный генно-инженерным способом.

Лабораторная диагностика гепатита С (ГС) Открытие возбудителя ГС стало возможным благодаря методам молекулярной биологии в 1989-1991 гг. Сначала путем клонирования был получен из сыворотки больных с гепатитом “ни-А, ни-В” вирусный геном, а затем был установлена и структура самого вируса. Физико-химическая характеристика вируса позволили отнести ВГС к семейству флавовирусов. Геном вируса ГС (ВГС) представлен однонитчатой позитивной РНК, состоящих из 10 000 нуклеотидных оснований, образующих регионы, которые кодируют три структурных белка (С, Е1, Е2) и пять неструктурных (NS2, NS3, NS4, NS5). Особенностью ВГС является чрезвычайно высокая гетерогенность его генома. Анализ нуклеиновых кислот РНК-ВГС различных изолятов выявил существенные отличия в их первичной структуре. На основании этих данных была построена классификация ВГС, разделяющая их на варианты ( их 6-9) и субтипы- генотипы, одни из которых присутствуют во всех регионах мира, а другие только в отдельных странах. Лабораторная диагностика ГС была решена при помощи современных методов молекулярной биологии, учитывая, что при ГС вирус находится в крайне низкой концентрации и его антигены не доступны выявлению с помощью современных методов индикации, усилия исследователей сосредоточены на выявлении антител к различным антигенным компонентам вируса, обнаружение которых может служить индикатором наличия вируса. В качестве антигенов использовали белки, кодированные структурной и неструктурной зоной РНК-ВГС, полученные при помощи рекомбинантной технологиии или синтеза (полипептиды, используемые в современных иммунологических методах – С22-3; С33с, С100-3, С200, NS5, S-1-1). Лабораторная диагностика ГС основывается на обнаружении серологических маркерв ВГС: антител к вирусу ГС (анти-ВГС, анти-ВГС класса IgМ, IgG) методом ИФА и РНК-ВГС методом ПЦР. К настоящему времени разработаны 4 поколения тест-систем для выявления анти-ВГС в иммуноферментном методе, но ИФА первого поколения сейчас не используется из-за низкой чувствительности. РНК-ВГС является показателем активной репликации ВГС и самым ранним маркером инфекции, и может быть обнаружена методом полимеразной цепной реакции уже через 1- 2 недели после инфицирования, незадолго до повышения уровня сывороточных трансаминаз. Анти-ВГС обнаруживаются к 5-6 неделе после начала гепатита в 80% случаев и к 12 неделе у 90% лиц методом иммуноферментного анализа. При определении анти-ВГС в некоторых случаях регистрируется ложноположительная реакция. Для разграничения ложноположительных образцов от образцов действительно содержащих антитела к ВГС, разработаны дополнительные тесты – рекомбинантный иммуноблотинг, определение спектра белков анти-ВГС. Иммуноблотинговые диагностикумы позволяют исключить неспецифический результат, полученный методом ИФА, однако визуальная оценка иммуноблотинговых полос может быть неоднозначной в разных диагностических центрах. В нашей стране более широкое распространение получили отечественные подтверждающие твердофазные иммуноферментные тест-системы (так называемы системы «Спектр»), основанные на определении антител к отдельным вирусным антигенам: core, NS3, NS4ab, NS5a. Выявление РНК ВГС считается «золотым» стандартом в диагностике ГС и подтверждением положительных результатов обнаружения анти-ВГС. В настоящее время для индикации РНК ВГС используется ПЦР в качественном и количественном варианте. Чувствительность методов определения РНК ВГС повышается с каждым годом, достигая в настоящее время 10-50 копий РНК в 1 мл крови. Диагноз хронического ГС у лиц с наличием анти-ВГС обычно ставится на основании повышенных печеночных проб в течение более 6 месяцев.

Лабораторная диагностика гепатита А (ГА) Вирус ГА (рис. 3) — это РНК- содержащий вирус, размером 27 нм, классифицированный как пикорнавирус. Во всех изолятах собранных в разных частях мира, наблюдается только один серотип ВГА. ВГА не имеет наружной оболочки, но состоит из наружной белковой капсулы, или капсида, содержащего внутри положительную одноцепочную РНК, который действует в качестве матрицы для выработки вирусных белков внутри клетки-хозяина. Лабораторная диагностика ГА основана на выявлении маркеров вируса ГА – антигена ВГА, антител (анти-ВГА класса IgМ и IgG ), а также РНК ВГА. Окончательным доказательством о текущей или недавней инфекции служит наличие в сыворотке крови (даже в одной пробе сыворотки) антител к ВГА класса IgM (анти-ВГА IgM) и наличие ВГА в фекалиях. На перенесенную инфекцию ГА, а также на длительный иммунитет, указывает наличие антител к ВГА класса IgG (анти-ВГА IgG). Диагноз острого ГА подтверждается в острой или ранней стадии выздоровления при наличии анти-ВГА класса IgM, которые появляются в последние 5-10 дней инкубационного периода и продолжают выявляться на протяжении 6-7 месяцев от начала заболевания. Кроме того, эти антитела могут быть выявлены в первые месяцы у лиц (20-30%), вакцинированных инактивированной вакциной против ГА. Их образование связано с первичным иммунным ответом на введение антигена, а не на инфекцию, вызванную вакциной. РНК ВГА может быть выявлена за несколько дней до повышения активности АлАТ и в течение 5 — 59 дней заболевания при типичном течении ГА; при затяжных случаях — РНК ВГА в среднем может определяться до 95 дней. Антиген вируса ГА (ВГА-Ag) обнаруживается в фекалиях больных за 7-10 дней до проявления клинических симптомов и в первые дни заболевания, что используется также для ранней диагностики и выявления источников возбудителя инфекции. Концентрация ВГА в фекалиях является наивысшей на протяжении 2-х нед. перед появлением желтухи. У взрослых выделение вируса с фекалиями продолжается обычно менее одной недели после появления желтухи. Вирус, однако, был обнаружен также через 2 мес. от начало заболевания (во время обострения). Дети могут выделять вирус более длительно, чем взрослые, возможно в течение нескольких недель после клинического проявления заболевания. Хроническое выделения ВГА из фекалий не отмечается. Определение антигена ВГА нашло также применение в санитарной вирусологии при исследовании воды на наличие вируса. Анти-ВГА класса IgG (рис. 4) также появляются рано в начале заболевания (с 3-4 недели), сохраняются на протяжении всей жизни и обеспечивают пожизненную защиту от этого заболевания. Определение анти-ВГА IgG используется для изучения иммуноструктуры населения, динамики специфического гуморального иммунитета. Определение анти-ВГА класса IgG важно также для пред- и поствакцинального скрининга (минимальная протективная концентрация анти-ВГА соответствует 20 МЕ/л). Для их определения отечественными производителями выпускаются коммерческие диагностические препараты иммуноферментного анализа. Лабораторная диагностика основана на выявлении маркеров вируса ГА с помощью специфических иммунодиагностических методов — методы ИФА, РИА. Отечественными и зарубежными промышленными биотехнологическими предприятиями выпускаются диагностические наборы, включающие все необходимые компоненты и реактивы для постановки теста. Кроме твердофазных ИФА и РИА с успехом применяется и метод иммуноэлектронной микроскопии, метод ПЦР. Все вышеупомянутые методы иммунодиагностики с равной вероятностью выявляют инаппарантные, бессмиптомные или клинически выраженные формы ГА. Особое место в лабораторной диагностике ГА занимают молекулярно-генетические методы тестирования РНК ВГА. ПЦР диагностика позволяет обнаружить РНК ВГА в концентрации 40 копий/мл. В настоящее время происходит накопление данных о месте ПЦР в системе лабораторной диагностики ГА.

Лабораторная диагностика гепатита Е (ГЕ) Этиологический агент гепатита Е (ГЕ) — это сферический вирус, лишенный внешней оболочки, это односпиральный РНК-вирус размером около 32-34 нм в диаметре. При постановке диагноза ГЕ в каждом отдельном случае необходимо принять во внимание несколько диагностических аргументов: — наличие у больного симптомокомплекса острого, и предположительно инфекционного гепатита, — надежное исключение этиологического участия вирусов ГА и ГВ, основанное на отрицательных результатах серологических тестов — анти-ВГА класса IgM и анти-НВс класса IgM, — тщательный анализ данных эпидемиологического анамнеза, включая указания на недавние выезды в эндемичные регионы, — исследование (по возможности) фекалий больного на присутствие частиц вируса ГЕ методом иммуноэлектронной микроскопии, ПЦР. Существуют диагностические методы, основанные на применении иммунофлюоресцирующих антител (МФА) для определения антигена ВГЕ в фекалиях и иммуноферментного анализа (ИФА) для определения антител к ВГЕ — анти-ВГЕ класса IgM и IgG. Наличие анти-ВГЕ класса IgM с высокой частотой определяются в сыворотках больных ГЕ в острой стадии заболевания и в период ранней реконвалесценции; выявление анти-ВГЕ класса IgG свидетельствуют о перенесенной в прошлом ГЕ — инфекции. Для диагностики ГЕ определяют также РНК ВГЕ. Отечественные фирмы производители диагностических тест-систем для выявления маркеров вирусных гепатитов:

МОСКВА и область — НИАРМЕДИК — ЭКОлаб — БИОСЕРВИС

НОВОСИБИРСК — ВЕКТОР БЕСТ — ВЕКТОР МБС ( МЕДИКОБИОЛ.СОЮЗ) — ВЕКТОР БИАЛЬГАМ

НИЖНИЙ НОВГОРОД — МИКРОГЕН (бывший ИМБИО) — ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ САНКТ-ПЕТЕРБУРГ — АВИЦЕННА — АКВАПАСТ

Лабораторная диагностика гепатита

Лабораторная диагностика гепатита

Лабораторная диагностика гепатитов — комплексное исследование, включающее в себя разные методы.
Диагностика гепатитов — это исследование крови на наличие в ней показателей, которые характерны для определенного вируса- маркеры. По своему составу- это либо частицы вируса, либо антитела к вирусу, которые являются результатом борьбы иммунитета человека.
Соотношение или наличие маркеров в крови изменяется в процессе течения заболевания и зависит от многих факторов (давность заболевания, стадия заболевания, активность и исход). Грамотная расшифровка всех этих показателей позволяет правильно поставить диагноз и составить схему лечения индивидуально для пациента. Довольно часто одного исследования может быть недостаточно, и только изменения маркеров при повторном анализе помогают увидеть картину полностью.

Биохимический анализ при гепатите.

Биохимический анализ крови включает в себя множество показателей, которые отражают функционирование печени. Такие показатели очень изменчивы, для правильной оценки течения болезни нужны многократные определения. Основные биохимические показатели при вирусных гепатитах – аминотрансферазы (ферменты печени), фосфатаза щелочная, билирубин, белок общий, белковый спектр крови.

Общий анализ крови при гепатите.

Общий анализ крови содержит в себе множество показателей, отражающие содержание клеток крови (эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, и т. д.). Уровни их изменяются при произвольном течении гепатитов. Например, у больных с циррозом, как правило, содержание тромбоцитов снижено. Противовирусное лечение также оказывает влияние на количество клеток крови (лейкоцитов). Контроль данных показателей связан с тем, что все виды кровяных клеток выполняют важные функции (защищают от инфекций, поддерживают нормальную свертываемость, обеспечивают ткани кислородом). Падение ниже критических уровней недопустимо. Именно поэтому регулярный общий анализ крови позволяет наиболее точно оценить состояние больного.

Лабораторная диагностика при гепатите в

Тип нуклеиновой кислоты

двунитчатая ДНК с однонитчатым участком

в среднем 25-30 дней

в среднем 60-90 дней, может быть до 6 месяцев

в среднем 35-70 дней

преимущественно дети до 1 5 лет

дети и взрослые

дети и взрослые

в течение всего года

в течение всего гоги

Переход в хрониче­скую форму

I. Гепатит А (гА). Лабораторная диагностика гА основывается либо на выявлении самого возбудителя (метод иммунной электронной микроскопии — ИЭМ), его антигенов (радиоиммунный, иммуноферментный, иммунофлюорес-центный метод — РИА, ИФА, ИФ) или антител к вирусу гА (РИА, ИФА).

Для ранней диагностики заболевания, а также выявления источников ин­фекции используется определение антигена вируса гА в фекалиях больных, где он появляется за 7-10 дней до клинических симптомов и в первые дни заболе­вания.

Из определяемых в настоящее время специфических маркёров гА важ­нейшими являются антитела класса Ig M к вирусу гА, которые появляются в сыворотке крови и слюне уже в начале заболевания и сохраняются в течение 3-6 месяцев. Обнаружение антител класса Ig M к вирусу гА однозначно свидетельствует о гепатите А и используется для диагностики заболевания, в том числе и бессимптомных случаев инфекции,и выявления источников инфекции в очагах.

Антитела к вирусу гА класса Ig G выявляются с 3-4-й недели заболевания и сохраняются длительно, что позволяет оценить состояние иммунитета насе­ления, динамику специфического гуморального иммунитета.

Вирус гепатита А в материале от больного можно выявить методом им­мунной электронной микроскопии. В основе метода лежит смешивание суспен­зии вируса с антисывороткой, отделение иммунных комплексов и исследование их в электронном микроскопе.

II. Гепатит В (гВ). В организме людей, заражённых вирусом гВ, с разной частотой и на разных этапах могут выявляться серологические маркёры: по­верхностный HBs Ag и сердцевинный НВе Ag, а также антитела к ним (anti-НВс, anti-HBe, anti-HBs). Динамика их появления и интерпретация результатов представлены в табл. 4 и 5.

Лабораторная диагностика вирусных гепатитов В и С

Результаты проведенных лабораторных исследований играют существенную, если не ведущую, роль для подтверждения диагноза вирусного гепатита и установления его этиологии.

Биохимический анализ крови

Биохимический анализ крови пациентов давно вошел в практику клинических лабораторий. Совокупность получаемых данных о показателях обмена биллирубина, сывороточных белках и ферментах позволяют обнаружить воспалительные процессы, происходящие в организме человека и предположить их локализацию. Эти критерии не специфичны и не характеризуют этиологию вирусных гепатитов, вместе с тем существенны для оценки функционального состояния печени.

Показатели обмена билирубина.

Оценить у пациента состояние обмена билирубина можно на основании биохимического анализа крови, мочи и кала. Свободный билирубин является производной гемоглобина, высвобождающегося в процессе гемолиза эритроцитов. В физиологических условиях каждые сутки гемолизируется примерно 1% циркулирующих эритроцитов, из которых образуется 200-250 мг билирубина. Основная часть билирубина поступает в кровяное русло из клеток системы мононуклеарных фагоцитов селезенки и костного мозга. Билирубин нерастворим в воде, поэтому в крови его перенос осуществляют неспецифические транспортные белки — альбумины. Свободный билирубин является токсичным соединением, способным проникать через гемато-энцефалический барьер, вызывая энцефалопатии. Детоксикация билирубина происходит в клетках печени, где к нему присоединяется глюкуроновая кислота, образуя глюкурониды билирубина. Эти соединения уже не токсичны и водорастворимы, что облегчает их выведение из организма в составе желчи. В кишечнике под действием бактериальных ферментов образуются две группы продуктов распада билирубина — уробилиногены и стеркобилиногены, основная часть которых выводится с калом. В нормальных физиологических условиях почки в выведении билирубина не участвуют.
Билирубин в крови здорового человека содержится в концентрации 1,7 — 17,1 мкмоль/л и представлен двумя фракциями: нерастворимый билирубин, связанный с альбумином — непрямой билирубин, и растворимые глюкорониды билирубина — прямой билирубин. В норме их соотношение составляет 3 : 1.
При гепатитах повреждаются клетки печени и, вследствие этого, снижается продукция желчи. Кроме того, в результате повреждения паренхимы печени желчь поступает не только в желчные канальцы, но и в кровь. Эти процессы приводят к увеличению общего билирубина крови за счет обоих его фракций. Отмечено, что уже в конце преджелтушного периода у части больных на фоне нормального общего билирубина начинает расти фракция прямого билирубина, что является ранним показателем цитолитических процессов в печени. В моче начинают выявляться билирубин и уробилины, а концентрация стеркобилина в кале резко снижается (таблица 1).
Таблица 1. Соотношение показателей обмена билирубина в норме и при развитии печеночной желтухи.

Общий билирубин сыворотки крови

1,7 — 17,1 мкмоль/л

Прямой билирубин сыворотки крови

Непрямой билирубин сыворотки крови

Реакция мочи на билирубин и уробилин

Реакция кала на стеркобилин

Следует отметить, что показатели обмена билирубина для диагностики вирусного гепатита играют роль только при развитии желтухи. Безжелтушная форма и преджелтушная фаза вирусных гепатитов в своем большинстве остаются нераспознанными.

Оценка активности ферментов.

Определение активности аминотрансфераз сыворотки (аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ)) является высокочувствительным показателем цитолиза гепатоцитов, что определяет ее ведущую роль в диагностике гепатитов различной этиологии. При цитолитическом процессе, развивающимся в печени больного вирусным гепатитом, преобладает «вымывание» АЛТ, степень повышения АСТ существенно меньше (таблица 2).

Таблица 2. Определение активности ферментов в сыворотке крови

Значения при гепатитах

Специфичность для гепатоцитов

Щелочная фосфатаза (ШФ)

31-115 Ед/л дети: до 350 Е/л

* значения приведены в соответствии с рекомендациями диагностических тест-систем, используемых в КДЛ НПФ «Литех»

Для дополнительного подтверждения гепатогенной природы ферментемии можно определить активность печеночноспецифических ферментов — сорбитдегидрогеназы, фруктозо-1-фосфатальдолазы, урокиназы и др. Они локализуются преимущественно в гепатоцитах и их выявление в крови однозначно связано с патологией печени. Вместе с тем, эти тесты уступают по чувствительности определению активности АЛТ. Активность АЛТ и АСТ отражает выраженность воспаления в печени, но не этиологию гепатита.

Белковые пробы

При острых вирусных гепатитах общее содержание белков плазмы крови и их состав практически не изменяются. Исключение представляет тимоловая проба, в норме имеющая значения до 4 ЕД и возрастающая до 6-8 ЕД при гепатитах.

При ХГ на стадии ЦП могут наблюдаться уменьшение концентрации альбумина в сыворотке крови, снижение протромбинового индекса (менее 70%), уменьшение концентрации других факторов свертывания крови в рамках синдрома печеночно-клеточной недостаточности. Дополнительными показателями активности гепатита являются ускорение СОЭ (і15 мм/ч), повышение концентрации гамма-глобулинов сыворотки.

Выявление серологических маркеров вирусных гепатитов

Установить вирусную природу гепатита и получить информацию об его этиологии возможно только путем выявления серологических маркеров вирусов гепатита. К таким маркерам относят вирусные белки (антигены), специфичные антитела, вырабатываемые организмом в ответ на инфекцию, и нуклеиновые кислоты вируса (ДНК или РНК), представляющие его геном.

Совокупность методов, позволяющих выявлять в биологических тканях и жидкостях специфические вирусные или бактериальные белки (антигены) или антитела, вырабатываемые в организме хозяина в присутствии того или иного возбудителя, относят к иммунологическим методам лабораторного анализа. За последние несколько десятилетий иммунологические методы исследования получили повсеместное распространение. Причиной этого явилось тесное слияние иммунологии и биотехнологии, которое позволило разработать и внедрить в практику широкий спектр тест-систем, основанных на взаимодействии антиген — антитело. Применительно к вирусным гепатитам, иммуноферментный анализ относится к непрямым методам обнаружения возбудителя, позволяющим установить этиологию болезни.

Сравнительно недавно в практику клинико-диагностических лабораторий вошли методы генодиагностики, позволяющие обнаруживать и характеризовать гены или несмысловые последовательности ДНК и/или РНК. Своим развитием эти методы обязаны разработкой в 1983 г принципа полимеразной цепной реакции (ПЦР). Первые сообщения по практическому применению ПЦР появились в 1985 г и с тех пор количество публикаций, где ПЦР используется в качестве одного из методов исследования, занимает одно из первых мест в мировой научной литературе. Эти подходы приложимы для обнаружения и исследования геномов инфекционных агентов, обнаружения маркеров онкологических заболеваний, выявления генетических изменений в геноме человека, связанных с теми или иными функциональными нарушениями. В отличие от ИФА, ПЦР-анализ относится к прямым методам обнаружения возбудителя в клиническом материале, что позволяет оценить активность вирусного процесса и проследить процессы распространения возбудителя в различных органах и тканях.

Серодиагностика вирусного гепатита В.

Вирус гепатита В (hepatitis B virus, HBV) относится к семейству Hepadnoviridae. Геном вируса представлен частично сдвоенной кольцевой молекулой ДНК размером 3200 п.н. При световой микроскопии HBV выглядит сферической частицей диаметром 42 нм (частица Дейна), состоящей из ядра — нуклеоида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого находится двуцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза. В состав нуклеоидного белка входят HBcAg и HBeAg. Внешняя оболочка (толщиной 7 нм) образована поверхностным антигеном HBV — HBsAg (рис. 2, 3). Вирус гепатита В является псевдоретровирусом, т. е. его ДНК может частично встраиваться в геном гепатоцитов.

Рис. 2. Схема строения вириона HBV и компонентов поверхностного антигена. Избыточная продукция поверхностного белка (HBsAg) приводит к его нахождению в сыворотке крови больного в свободном виде.

Рис. 3. Частицы Дейна в сыворотке крови больного (световая микроскопия)

При ОВГ и обострении ХГ вирусные частицы можно обнаружить в гепатоцитах и сыворотке крови больного. При интегративной форме ХГ В и в стадии ремиссии HBV в сыворотке крови не выявляется.

Основой лабораторной диагностики инфекции HBV является определение серологических маркеров инфицирования вирусом: HBsAg, HВeAg, анти-НВс класса IgM и IgG, анти-НВе и анти-HBs, HBV ДНК и активности вирусной ДНК — полимеразы. В зависимости от течения вирусного гепатита В спектр изменения серологических маркеров выглядит по-разному (рис 4, 5)

Рис. 4. Спектр изменения серологических маркеров при остром гепатите В со стадией разрешения

Рис 5. Спектр изменения серологических маркеров при хронизации острого гепатита В

HBsAg — основной маркер инфицирования HBV. При остром вирусном В в большинстве случаев (90-80 %) HBsAg удается выявить в инкубационном периоде, начиная с 3-5-й недели заражения. Средняя продолжительность циркуляции антигена — 70-80 дней. Быстрое исчезновение HBsAg (в первые дни желтухи) с появлением антиНВs — плохой прогностический признак. При хроническом гепатите В HBsAg может циркулировать в крови больного на протяжении многих лет. Следует отметить, что применяющиеся в настоящее время методы определения HBsAg, в том числе ИФА, имеют порог чувствительности. Поэтому при наличии клинических признаков гепатита и отсутствиии HBsAg в сыворотке крови необходимо исследовать другие маркеры инфекции HBV. Наличие HBsAg в крови свидетельствует о присутствии вируса в печени и с большой долей вероятности в крови. Не всякая сыворотка, содержащая HВsAg, содержит вирус гепатита В. В ряде случаев ДНК вируса встраивается в ДНК гепатоцита не полностью, а частично, только тем участком, который кодирует синтез HBsAg. В этих случаях синтезируются HBsAg без других компонентов вириона, (то есть без других антигенов). Считают, что такая ситуация возникает при «здоровом» носительстве HBsAg.

HBeAg вируса гепатита В характеризует высокую инфекционность крови, являясь показателем активной репликации HBV. HBeAg циркулирует в крови больного только в присутствии HBsAg. В первую неделю желтушного периода он выявляется у 85-95 % больных. Выявление HBeAg в течение двух и более месяцев служит прогностическим признаком развития хронического гепатита. У большинства больных хроническим гепатитом с высокой активностью процесса HBeAg сохраняется на длительный срок (до нескольких лет).

Антитела к ядерному антигену вируса гепатита В класса M (анти-НВc IgM) — маркер активной репликации НВV и острой инфекции. Выявляются через 1-2 недели после обнаружения HBsAg и сохраняются на протяжении 2-18 месяцев. У 4-20 % больных острым гепатитом В анти-HBc IgM являются единственным маркером инфекции. При ХГ В анти-НВс IgM могут быть выявлены у некоторых больных в меньших титрах, чем при острой инфекции, причем титр антител отражает тяжесть гепатита.

Антитела к HBcAg класса G (анти-НВс IgG) появляются практически одновременно с анти-НВс IgM. Как првило, они остаются у всех лиц, переболевших гепатитом В, пожизненно. У 95 % носителей HBsAg наряду с HBsAg циркулируют и анти-НВс IgG.

Антитела к HBsAg (анти-НВs) свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции или о наличии поствакцинального иммунитета (защитный уровень — 10 МЕ/мл). Они появляются в период выздоровления, через 4 недели после исчезновения HBsAg, достигая максимальной концентрации через 1-2 года, с последующим постепенным снижением уровня, недоступного выявлению современными методами диагностики. В некоторых случаях анти-HВs могут циркулировать пожизненно. Появление анти-HBs на фоне клинического улучшения у больного гепатитом В является хорошим прогностическим признаком. Важно отметить, что в динамике острой инфекции HBV имеется «окно», когда HBsAg уже не определяется, а анти-HBs еще не появились. При этом выявляются анти-HBc IgM и IgG. Из этого следует вывод о необходимости обследования больных ОВГ на анти-HBc IgM даже при отрицательных результатах исследования HBsAg и анти-НВs.

Антитела к HBeAg (анти-НВе) появляются в крови после элиминации HBeAg и завершения репликации вируса. К концу 9-й недели острого периода гепатита В более 90 % больных имеют анти-НВе. В период выздоровления анти-НВе могут исчезать. Однако, наличие анти-НВе не является показателем отсутствия инфекционности конкретной сыворотки крови. Показано, что у ряда больных в ходе развития гепатита В (около 10%) под влиянием «иммунного давления» на вирус возникают мутантные формы, которые «избегают» иммунного надзора и не элиминируются. У носителей анти-HBe был выделен мутант, неспособный продуцировать HBeAg из-за дефектов в области precore и получивший обозначение HBeAg-отрицательного. Появление HBeAg-отрицательного мутанта приводит к прогрессированию поражения печени при продолжающейся репликации вируса (наличие ДНК HBV в сыворотке крови). При первичном инфицировании HBeAg-отрицательным мутантом существенно возрастает риск развития фульминантного гепатита.

Описанные маркеры гепатита В исследуются методом ИФА. Спектр антител (анти-НВе, анти-НВs, анти-НВc IgM, анти-НВc IgG) и антигенов (HBsAg, HBeAg) позволяет установить диагноз гепатита В и определить стадию заболевания (таблица 3). Недостатком данного метода является невозможность его использования при заражении мутантными формами вируса, при иммуносупрессии (больные онкологическими заболеваниями, наркоманы и т.д.) и для количественной оценки присутствующего в организме возбудителя. Решение этих задач стало возможным в результате внедрения молекулярно-биологических методов в практику клинико-диагностических лабораторий.

Таблица 3. Различные сочетания серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В и их интерпретация

антиНВc
IgM

антиНВ
c сумм

Методы генодиагностики, к которым относится ПЦР, существенно расширяют возможности лабораторной диагностики вирусного В, позволяя непосредственно выявить возбудитель, установить тканевую и внутриклеточную локализацию HBV, выявить и охарактеризовать мутантные формы вируса, оценить уровень виремии в течение заболевания, в том числе — на фоне противовирусной терапии.

В настоящее время существует широкий спектр диагностических тест-систем для выявления ДНК HBV в лабораторных условиях, основанных на методах ПЦР — фирмы «Roche», НПФ «Литех», «ДНК технология», LCR (лигазная цепная реакция) — фирма «Abbott», bDNA (метод «развлетвленных» ДНК зондов) — фирма «Chiron». Эти тест-системы позволяют проводить качественное определение наличия возбудителя в биологическом материале: сыворотке или плазме крови, ткани печени, мононуклеарах. Одним из вариантов качественного определения ДНК HBV является технология ПЦР in situ (в гистологических срезах), позволяющая установить внутриклеточную локализацию вируса в гепатоцитах.

Единственная коммерческая тест-система дифференциальной диагностики НВеAg-отрицательного гепатита В создана фирмой «Abbot» с использованием LCR. Существенным недостатком этой системы является выявление только одной из многих мутаций, приводящих к отсутствию синтеза НВеAg вирусом. Выявление всей совокупности генетических изменений, характерных для НВеAg-отрицательных вирусов гепатита В, возможно пока только прямым секвенированием ПЦР-амплифицированных фрагментов вирусного генома.

Количественная характеристика содержания ДНК HBV в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии и имеет прогностическое значение для определения хронизации HBV. При исходно низком уровне виремии (ДНК HBV менее 500 фг/мкл) процент хронизации острого гепатита В близок к нулю, при концентрации HBV ДНК от 500 до 2000 фг/мкл хронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком уровне виремии у пациента (более 2000 фг/мкл) острый гепатит В чаще всего переходит в хронический.

Известные коммерческие тест-системы оценки концентрации ДНК HBV реализуют принцип конкурентного ПЦР-анализа с последующей гибридизационной схемой определения продуктов амплификации (фирма «Roche», НПФ «Литех»). Этот подход основан на внесении в клинический образец внутреннего стандарта известной концентрации, качественно отличающегося от определяемой матрицы. После ПЦР концентрация ДНК HBV в исследуемом материале рассчитывается на основании известной концентрации внутреннего стандарта и соотношения накопления продуктов амплификации внутреннего стандарта и определяемой матрицы.

В настоящий момент развитие методов лабораторной диагностики гепатита В идет по направлению создания коммерческих тест-систем для идентификации клинически значимых мутантных штаммов HBV, а также использованию новых оптических приборов (биосенсоров) для комплексной диагностики инфекции HBV (вирусных белков, антител к ним и ДНК HBV)

Серодиагностика гепатита С

Вирус гепатита С (hepatitis C virus, HCV) является РНК содержащим гепатотропным и лимфотропным вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной молекулой (+) РНК размером около 9500 оснований, кодирующей структурные и неструктурные белки (рис. 6).

Рис. 6. Схема геномной РНК НCV и синтеза вирусных белков

К структурным белкам относят белок сердцевины (кор) и гликопротеины оболочки (Е1 и Е2). Неструктурную область представляет комплекс белков с ферментативной активностью, в первую очередь РНК-зависимая — РНК полимераза. Помимо вирусных белков, снаружи вирион покрыт липидной оболочкой состоящей из липопротеинов организма хозяина низкой плотности (рис. 7).

Рис. 7. Схема строения вириона вируса гепатита С.

До 1990 г. ХГ ни-А-ни-В с парентеральным путем передачи диагностировали на основании повышенной активности АЛТ сыворотки в течение 6 месяцев, при отсутствии других известных маркеров вирусных гепатитов. Однако у части больных ХГ С уровень АЛТ не повышается. В современной диагностике гепатита С основная роль отводится определению антител к HCV и выявлению РНК HCV.

В отличие от гепатита В, при котором могут быть определены антигены вируса и антитела к ним, при гепатите С методом ИФА улавливаются только антитела. Антигены HCV, если и попадают в кровь, то в количествах, которые практически не улавливаются. Они могут быть обнаружены только в ткани печени при использовании иммунногистохимических методов исследования. Это существенно ограничивает возможность оценки течения и активности инфекционного процесса.

Анти-HCV не свидетельствуют о продолжающейся репликации вируса, и могут являться признаком как текущей, так и перенесенной инфекции. Приходится также учитывать, что у реципиентов, которым была перелита инфицированная кровь, могут обнаруживаться анти-HCV донора, не обязательно свидетельствующие о заражении HCV. У больных ХГ С анти-HCV обнаруживаются в крови не только в свободной форме, но и в составе циркулирующих иммунных комплексов.

Антитела образуются к каждому из вирусных белков, расположенных в структурной и неструктурной области вирусного генома. Этим определяется их различная специфичность и, соответственно, разная диагностическая информативность. Для скрининга гепатита С используют метод ИФА, а в качестве подтверждающего теста — метод иммунноблота (RIBA). Существует несколько поколений диагностических тест-систем для выявления анти-HCV, отличающихся своей чувствительностью и специфичностью (таблица 4).

Таблица 4. Сравнение разных поколений диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВГС.

*Тест-системы 4-го поколения содержат синтетические и рекомбинантные вирусные антигены, размеры которых могут отличаться от фрагментов 3-го поколения.

Первая диагностическая тест-система на основе определения антител к С-100-3 была разработана в 1989 году в лаборатории М. Houghton и быстро получила повсеместное распространение. Она позволяла улавливать антитела в зоне, характеризующей всего 12% вирусного белка в неструктурной области (NS3, NS4). Кроме того, искусственный рекомбинантный антиген С-100-3 не полностью совпадает с натуральными вирусными белками, что предопределяет его слабую иммунногенность. Антитела к С-протеину (кор Ag) с помощью антигена С-100-3 вообще не улавливаются. Это предопределило низкую специфичность определения анти-HCV и большое число ложноотрицательных результатов, особенно при ХГ С. У больных с выраженной гипергаммаглобулинемией наоборот, тест С-100-3 часто является ложноположительным.

Тест-системы 2-го поколения, возникшие в 1991 году, позволяют улавливать антитела к белкам в разных зонах генома не только неструктурной, но и структурной области. Их преимуществом явилась, прежде всего, высокая специфичность, а также возможность более полного представительства спектра антигенов HCV. Использование тест-систем 2-го поколения позволило существенно улучшить отбор доноров и уменьшить угрозу развития посттрансфузионного гепатита С.

При использовании тест-систем 2-го поколения также не исключены ложноотрицательные результаты, в частности, у больных с необычными для данного региона генотипами HCV. Наиболее совершенны тест-системы 3-го и 4-го поколения, использующиеся в клинической практике начиная с 1995 года.

Тест-системы 3-го и 4-го поколения позволяют выявить анти-HCV в 99,7% случаев. В некоторых случаях антитела к HCV могут не обнаруживаться, например, при запаздывании иммунного ответа, применении иммуносупрессивной терапии или иммуносупрессии на фоне онкологического заболевания, приема наркотических веществ и т.д. Очень редко наблюдаются ложноположительные результаты. Для их исключения сомнительные сыворотки анализируют в RIBA или INNO LIA тестах, которые выявляют антитела к каждому отдельному белку HCV. Установление диагноза гепатита С и наблюдения за больными часто бывают затруднены при использовании только классических методов лабораторной диагностики. Это связано с особенностями протекания инфекции HCV, в течение которой могут наблюдаться: бессимптомное течение начальных стадий заболевания; низкий, часто нормальный уровень АЛТ; позднее появление антител (до 2-х лет от начала заболевания); отсутствие надежной тест-системы для выявления вирусных белков. Генодиагностика гепатита С Ведущую позицию в лабораторной диагностике инфекции HCV занимают методы генодиагностики, позволяя: непосредственно выявить генетический материал вируса в сыворотке крови и тканях человеческого организма (мононуклеарах, гепатоцитах, ткани костного мозга и т.д.); оценить репликативную активность вируса в тканях; количественно определить концентрацию вируса в сыворотке крови; установить генотип вируса и вести наблюдение за изменчивостью HCV. Обнаружение в сыворотке крови РНК HCV является «золотым стандартом» диагностики, свидетельствующем о продолжающейся репликации HCV. По рекомендации ВОЗ установление диагноза гепатита С возможно на основании троекратного обнаружения HCV РНК в сыворотке крови больного при отсутствии других маркеров гепатита. В острую фазу гепатита РНК выявляется в крови уже через 1-2 недели после заражения, т.е. задолго до появления анти-HCV. При всей неоднородности популяции HCV, все генетические варианты вируса имеют консервативный участок в 5′-нетранслируемой области генома, на обнаружении, которого основаны большинство известных диагностических тест-систем для выявления РНК HCV. До недавнего времени самым чувствительным тестом при определении РНК HCV считался тест Amplicor HCV фирмы «Roche», позволяющий выявлять 700 копий РНК в 1 мл. С помощью нового набора Abbott LCx можно определять 200 копий РНК/мл. Менее чувствительным, но широко распространенным в настоящее время является тест bDNA Quantiplex (фирма «Chiron»). Отечественные тест-системы основаны на определении РНК HCV в клиническом образце методом RT-PCR c использованием в качестве мишени амплификации консервативной 5′ не транслируемой области вирусного генома (НПФ «Литех», ДНК-технология). Проведение ПЦР позволяет выявить РНК HCV не только в сыворотке крове, но и в ткани печени, что важно в подтверждении роли HCV в формировании гепатоцеллюлярной карциномы. У данной категории больных РНК HCV регистрируется в гепатоцитах и при отсутствии анти-HCV и HCV РНК в сыворотке крови. Отличительной особенностью течения инфекции HCV является развитие многочисленных внепеченочных проявлений, что требует наблюдения за распространением вируса в организме. Методом ПЦР РНК HCV определяется в мононуклеарах крови, криопреципитатах, ткани клеточного мозга, биопсии печени и мышечной ткани. Существует методологический подход, позволяющий не просто определять наличие вируса в ткани, но и оценивать его репликативную активность — реакция на (-) цепь РНК. При наблюдении за больными ХГ С существенную роль играют количественная оценка содержания вируса в сыворотке или плазме крови больного и определение генотипа HCV. Наиболее благоприятный ответ на противовирусное лечение наблюдается у лиц с низким уровнем виремии и генотипом 2 или 3. В основе известных диагностических тест-систем количественной оценки содержания HCV лежит подход, основанный на принципе конкурентной амплификации РНК HCV и внутреннего стандарта. В первую очередь это диагностикумы «Amplicor HCV monitor kit» фирмы «Roche» и «NASBA HCV» («Organon»). Количественные тест-системы фирмы «Chiron» bDNA Quantiplex, которые позволяют непосредственно оценить концентрацию матрицы в образце по интенсивности регистрируемого сигнала. Эти тест-системы отличаются надежностью, лучшей воспроизводимостью, но более низким уровнем чувствительности, по сравнению с амплификационными. Сотрудниками фирм Gen-Probe и Bayer Diagnostics опубликованы результаты количественного определения РНК HCV методом TMA (transcription-mediated amplification) с очень низким порогом чувствительности — 50 копий/мл. Большинство отечественных лабораторий для оценки концентрации РНК HCV используют метод предельных разведений. В основе его лежит раститровка анализируемой матрицы до исчезающих концентраций и вычисление исходной концентрации на основании результатов амплификации в сравнении с калибровочной кривой. К сожалению, этот метод не достаточно точен, так как не учитывает возможность подавления реакции амплификации в пробирке с исследуемым образцом. Тем не менее, метод достаточно прост в исполнении и до сих пор используется в ряде лабораторий для «внутреннего пользования» (in house). Существенной особенностью характеристики HCV является его генетическая неоднородность, соответствующая особенно быстрой замещаемости нуклеотидов. В результате образуется большое число разных генотипов и субтипов. По классификации Simmonds разграничивают 11 типов (генотипы 1-11), в свою очередь подразделяющихся на 70 подтипов (например, подтипы 1а, 1в, 1с) HCV. Особенно много субтипов HCV регистрируется в Африке и Юго-Восточной Азии. Это косвенно подтверждает существование HCV в этих регионах уже в течение нескольких столетий. Допускают, что в Европе и Северной Америке HCV появился позже, чему и соответствует существенно меньшее число субтипов. Для клинической практики достаточно разграничивать 5 субтипов HCV: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a. Установлены географические различия в распространении разных генотипов. Так, в Японии, на Тайване, частично в Китае, регистрируются преимущественно генотипы 1b, 2a, 2b. Тип 1b даже называют «японским». В США преобладает 1a — «американский» генотип. В Европейских странах преобладает генотип HCV 1a, в Южной Европе заметно возрастает доля генотипа 1b. На территории Российской Федерации преобладающим генотипом является 1b, составляющий 80 % популяции вируса, далее с убывающей частотой — 3a, 1a, 2a . Обычным методологическим подходом для типирования HCV является обнаружение характерных генетических изменений (мутаций) в консервативных областях вирусного генома — 5′ нетранслируемой, Кор, NS5A областях. Типирование HCV представляет собой амплификацию консервативных областей вирусного генома и анализ специфичных нуклеотидных последовательностей методами: прямого секвенирования амплифицированных фрагментов последующей ПЦР с типоспецифичными праймерами RFLP (анализ амплифицированных фрагментов с помощью ферментов рестрикции) обратной гибридизации с типоспецифичными зондами (LiPA) SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК) Для установления генотипа HCV создана коммерческая тест-система InnoLiPA HCV («Innogenetics»), в основе которой лежит принцип обратной гибридизации с типоспецифичными зондами (рис. 8). 1- 1а генотип 2- 1в генотип 3– 2а генотип 4– 1в + 3а генотип 5– 2в генотип 6– 1а + 2а генотип 7– отрицательный контроль амплификации Рис. 8. Установление генотипа вируса гепатита С с использованием тест-системы «InnoLiPA HCV» В ряде крупных диагностических центров типирование HCV проводят по оригинальным методикам, используя ПЦР с типоспецифичными праймерами, рестриктазный анализ фрагментов ДНК (RFLP), или конформационный анализ одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP). Так, в клинико-диагностической лаборатории НПФ «Литех» генотип вируса определяется методом ПЦР-SSCP (рис. 9) или аллель-специфичной амплификацией с соответствующими праймерами. Рис 9. Генотипирование HCV РНК методом SSCP анализа:1-5 генотип 1в 6 — 1а7 — 2а8 — 3а Установлено, что популяция HCV не однородна у каждого пациента. HCV циркулирует в организме человека в виде гетерогенной смеси близкородственных мутантных штаммов, принадлежащих к одному генотипу вируса, но имеющих генетические отличия в вариабельных областях вирусного генома. Генетически отличающиеся друг от друга варианты ВГС, циркулирующие в организме одного хозяина, получили название «квазивидов». Исключительной нестабильностью характеризуется регион Е2/NS1, содержащий всего 80 нуклеотидов и получивший название гипервариабельного региона (НVR1). Предполагают, что именно антитела к белкам, кодируемым участком генома Е2/NS1, обладают вируснейтрализующими свойствами. Исключительная нестабильностью HVR1 региона приводит к тому, что вирусу удается изменить свою антигенную структуру, в связи с чем иммунокомпетентные клетки не в состоянии распознать непрерывно обновляющиеся антигены. С наличием «квазивидов» связывают феномен ускользания вируса от иммунного ответа, неэффективное удаление HCV, и, как следствие, его длительное сохранение в организме человека и высокий процент хронизации инфекции. Оценку гетерогенности индивидуальной популяции HCV принято проводить на основании регистрации числа генетических вариантов HVR1 вирусного генома методами гетеродуплексного анализа или SSCP. По данным некоторых зарубежных исследователей, высокий уровень гетерогенности индивидуальной популяции HCV по HVR локусу обуславливает более тяжелое течение ХГ С с волнообразным характером колебания уровня тканевых трансаминаз и толерантностью к противовирусной терапии. Собственные исследования, проведенные на базе НИИ Физико-химической медицины показали, что регистрация генетических изменений популяции HCV при остром гепатите С не имеет прогностической значимости, как и в ряде случаев ХГ С. Таким образом, приходится рассматривать генетическую гетерогенность как адаптивную реакцию вируса, живущего в изменяющихся условиях организма хозяина, что подтверждается различиями в субпопуляциях HCV гепатоцитов, мононуклеаров и сыворотки крови человека. Кроме того, наблюдаемая в динамике генетическая изменчивость индивидуальной популяции HCV, наряду с изменением концентрации вируса в сыворотке крови больного, может служить косвенным маркером активности репликативного процесса, происходящего в клетках печени. Лабораторная диагностика гепатита С развивается по пути создания новых, более совершенных тест-систем. Ortho Clinic Diagnostic начала выпуск нового иммуноферментного набора для определения кор антигена в крови. Первым этапом является освобождение антигенов из клеточных структур путем лизирования сыворотки, вторым — улавливание антигенов с помощью специфических моноклональных антител. Данный тест особенно удобен при выявлении ранней стадии инфекции HCV, когда еще не появились вирус-специфические антитела. Фирмы Chiron и Gen-Probe предлагают новый амплификационный тест — NAT assay — для выявления РНК как HCV, так и HIV, способный улавливать единичные копии вируса в анализируемом материале. В заключении следует упомянуть о необходимости комплексного обследования больного с привлечением новейших достижений медицинской и биологической науки для правильной диагностики вирусных гепатитов и назначения адекватной терапии больному.